VectorBuilder에서 직접 벡터 디자인하기
Step 1:
VectorBuilder 홈페이지에서 고객 맞춤형 벡터 디자인을 클릭하면, Choose Vector System for Vector Design 페이지로 이동됩니다. 여기서는 사용 가능한 벡터 시스템의 포괄적인 목록을 볼 수 있습니다. 그런 다음 Go to Design 버튼을 클릭하여 원하는 벡터 시스템을 선택할 수 있습니다. 예를 들어 mammalian cells에 관심 있는 유전자를 발현하기 위한 lentiviral vector를 디자인하려면 Mammalian Gene Expression Vectors 섹션 아래의Lentivirus 옆에 있는 Go to Design 버튼을 클릭하시면 됩니다.
벡터 시스템에 대한 자세한 기술 정보는 벡터 시스템 안내 페이지를 참조하세요.
Step 2:
벡터 시스템을 선택하면 Vector Design Studio 페이지로 들어갑니다. 여기서는 선택한 벡터 시스템의 map이 보여집니다. Map에는 두가지 타입의 구성 요소가 표시되어 있습니다. 하나는 변경할 수 없는 고정된 구성 요소로 벡터의 backbone 역할을 합니다. 다른 하나는 backbone에 추가할 수 있는 custom 구성 요소입니다. 유전자를 발현하는 promoter, promoter 뒤에 위치한 ORF, drug-selection marker나 fluorescent reporter 등의 추가 기능을 custom 구성 요소로 하나씩 입력할 수 있습니다. 구성 요소를 추가할 때는 VectorBuilder의 구성 요소 데이터베이스에서 구성 요소를 선택하거나, 자신의 서열을 붙여 넣을 수 있는 옵션이 제공됩니다. ORF를 추가할 때는 ORF에 epitope tags를 삽입하거나 mutations을 도입하는 옵션도 제공됩니다. 다음은 몇 가지 유용한 팁입니다.
데이터베이스에서 구성 요소 선택하기: 광범위한 구성 요소 데이터베이스에는 두가지 카테고리의 서열을 포함하고 있습니다. 하나는 CMV, EF1A 및 CAG와 같은 일반적인 promoter 중에서 쉽게 선택할 수 있도록 리스트로 제시된 구성 요소입니다. 다른 하나는 ORF, shRNA 및 gRNA에 대한 유전자 기반 데이터베이스에서 생물종과 유전자명으로 검색해 관심 유전자에 해당하는 구성 요소를 검색할 수 있습니다. 예를 들어 human BMP2 유전자를 발현하는 lentiviral vector를 디자인하려면, Add ORF 단계의 drop-down 메뉴에서 Select from ORF database 선택하고 human BMP2를 검색하면 됩니다. 이 유전자에 대한 모든 RefSeq transcripts의 리스트가 보여지고, 그중 하나는 VectorBuilder에서 추천하는 것입니다. 그런 다음 transcripts 중 하나의 ORF를 선택하여 벡터에 추가할 수 있습니다. 또한 벡터에 ORF를 추가하기 전에 ORF 서열을 편집할 (예: ORF에 epitope tags를 삽입하거나 mutations 도입) 수도 있습니다.
구성 요소에 대한 자세한 기술 정보는 벡터 구성 요소 안내 페이지를 참조하세요.
ORF 편집 기능: ORF에 epitope tags를 삽입하거나 point mutations을 넣을 수 있습니다. 벡터에 ORF를 이미 추가한 후에도 ORF 편집이 가능합니다. 벡터 map에서 ORF를 클릭하고 drop-down 메뉴에서 Edit ORF 를 선택하십시오. 이렇게 하면 변경 가능한 sequence editor 화면이 열리게 됩니다. 서열 아래의 Add tag 버튼을 클릭하면 다양한 tags 정보가 보이고, ORF의 N 말단 또는 C 말단 중 어느 곳에나 추가할 수 있습니다. 또한 직접 nucleotides를 입력하거나 삭제하여 서열을 편집할 수도 있습니다. VectorBuilder 데이터베이스에서 검색된 구성 요소를 편집하는 경우, 원래 reference 서열에 대한 편집 기록이 남습니다. Sequence editor 화면에는 Translate, Find ORF 및 View Opposite Strand 기능이 있습니다.
단일 promoter 뒤에 여러 ORF 넣기: 유전자 발현 벡터를 설계할 때 promoter 뒤에 polycistron으로 최대 4개의 ORF를 넣을 수 있습니다. 복수의 ORF는 단일 fusion protein 또는 2A, IRES linker를 사용해 각각의 단백질로 발현시킬 수 있습니다. Vector Design Studio 화면의 왼쪽 상단 모서리에 있는 Select number of ORFs 옵션을 사용하면 프로모터 뒤에 배치할 ORF 수를 변경할 수 있습니다.
Step 3:
벡터 디자인을 마무리하고, Finish Design을 클릭하면 Vector Information 페이지로 이동되며, 여기서는 디자인한 벡터의 모든 정보가 포함된 map과 서열을 확인할 수 있습니다. 또한, 장바구니에 넣거나 사용자 계정에 저장 또는 동료와 공유할 수 있습니다. 벡터 정보는 논문 발표 수준의 그래픽을 포함한 PDF 포맷으로 다운로드 가능합니다. 염기서열은 GenBank 포맷으로 다운로드 받을 수 있으며, 대부분의 벡터 디자인 소프트웨어 및 텍스트 편집기에서도 사용 가능합니다.